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betway88官网凋亡必威体育登陆步骤及注意事项

金达阳光 • 2015/1/26 11:40:27 • 来源:51jinda.com • 点击:3224

一、必威体育登陆目的

1、掌屋凋亡betway88官网的形态特征

 2、学会用荧光探针对betway88官网进行双标记来检测正常活betway88官网、凋亡betway88官网和坏死betway88官网的方法

二、必威体育登陆原理

betway88官网死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界,在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是betway88官网在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合,是betway88官网遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。betway88官网凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。

在形态上可见凋亡betway88官网与周围betway88官网脱离接触,betway88官网变园,betway88官网膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、betway88官网核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和betway88官网膜进一步融合将betway88官网分成多个完整包裹的凋亡小体,凋亡小体最后被吞噬betway88官网吞噬消化。在凋亡过程中betway88官网内容物并不释放到betway88官网外,不会影响其它betway88官网,因而不引起炎症反应。

在生物化学上,多数betway88官网凋亡的过程中,内源性核酸内切酶活化,活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断,降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳,可显示以180-200bp为基数的DNA ladder(梯状带纹)的特征。

相比之下,坏死是betway88官网处于剧烈损伤条件下发生的betway88官网死亡。betway88官网在坏死早期即丧失质膜完整性,各种betway88官网器膨胀,进而质膜崩解释放出其中的内容物,引起炎症反应,坏死过程中betway88官网核DNA虽也降解,但由于存在各种长度不等的DNA片断,不能形成梯状带纹,而呈弥散状。

一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导betway88官网凋亡,通常这些因素在诱导凋亡的同时,也可产生betway88官网坏死,这取决于损伤的剧烈程度和betway88官网本身对刺激的敏感程度。

三尖杉酯碱(HT)是我国自行研制的一种对急性粒betway88官网白血病,急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时,即可诱导HL-60betway88官网凋亡,并表现出典型的凋亡特征。本必威体育登陆用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60betway88官网发生凋亡,同时也有少数betway88官网发生坏死。用Hoechst33342和碘化丙啶(propidium iodide,PI)对betway88官网进行双重染色,可以区别凋亡、坏死及正常betway88官网。

betway88官网膜是一选择性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当betway88官网坏死时,质膜不完整,PI就进入betway88官网内部,它可嵌入到DNA或RNA中,使坏死betway88官网着色,凋亡betway88官网和活betway88官网不着色。而一些活betway88官网染料由于为亲脂性物质,可跨膜进入活betway88官网,因而可进行活betway88官网染色。Hoechst33342是一种活性荧光染料且毒性较弱,它是双苯并咪唑的一种衍生物。与DNA特异结合(主要结合于A-T)碱基区),显示凋亡betway88官网和活betway88官网。凡是看到有凋亡小体的betway88官网都是凋亡betway88官网。

三、必威体育登陆用品

1、试剂:三尖杉酯碱(HT),300μg/ml,100mmol/L Tris-HCl(pH7.5),5mol/L EDTA缓冲液、碱性裂解液:0.2mol/L NaOH, 1%SDS、醋酸钠:3mol/L KAc(pH4.8);异丙醇;70%乙醇;溴酚蓝,蔗糖指示剂。TBE电泳缓冲液,1%琼脂糖,溴乙锭。PI母液:500μg/ml;Ho33342母液:2mmol/L。

 2、仪器设备:荧光显微镜,电泳仪,电泳槽,微量加样器(1ml,100μl)0.5、1.5ml离心管,载玻片,盖玻片。

四、必威体育登陆材料

人早幼粒白血病HL-60betway88官网,用含10%小牛血清的RPMI1640培养基在37℃,5%CO2条件下培养。

五、方法步骤

1、三尖杉酯碱诱发HL-60betway88官网凋亡

(1)必威体育登陆前约24小时,接种两瓶HL-60betway88官网,标记①、②,每瓶含约6ml培养液,置37℃,5%CO2培养箱培养。

(2)必威体育登陆前约2.5小时,当betway88官网密度达到70%,①号瓶加入三尖杉酯碱200μl,使终浓度为1μg/ml,②号瓶中加入同等量PBS(pH7.4)作对照。共同放入培养箱中继续培养2.5小时。

2、Ho33342和PI双重染色鉴别三种betway88官网

(1)染色:将瓶中的betway88官网摇匀取200μl于1.5ml的离心管中,加入Ho33342母液2μl,PI 20μl,染色15分钟。

(2)滴片:取一载玻片用双面胶围成一小室,从离心管中各取以上染色后的betway88官网悬液10μl,加入小室内盖上盖玻片,荧光镜下用紫外激发光,高倍镜下观察,区别三种betway88官网,并注意三者比例。

六、注意事项

1、诱导培养HL-60betway88官网时间要准确;

2、荧光显微镜下观察betway88官网时,由于荧光易碎灭,观察时要尽量快。

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